(Glutathione- S- Transferase) درمواد دفعی- ترشحی
انگل فاسيولا ( Fasciola)
GST
حشمت اله علی رحمی¹- دکتر علی فرهناک2- دکتر تقی گل محمدی3- خانم منیژه روحنواز2
1- اداره کل دامپزشکی استان ایلام – آزمایشگاه مرکزی
2- دانشگاه علوم پزشکی تهران - دانشکده بهداشت و انستیتو تحقیقات بهداشتی- گروه انگل شناسی وقارچ شناسی
3- دانشگاه علوم پزشکی تهران – دانشکده پزشکی – گروه بیوشیمی
مقدمه:
انگل فاسیولا عامل بیماری فاسیولیازیس است که یک انگل کبدی با گسترش جهانی می باشد [1] ،این انگل ها از جالبترین ودر عین حال از مهمترین موضوعات علم انگل شناسی هستند . سیر تکاملی کرم پیچیده بوده و شامل انسان ، گاو وگوسفند به عنوان میزبان نهایی و حلزون های خانواده لیمنه به عنوان میزبان واسط و گیاهان آبی خود روی به عنوان حاملین فرم عفونت زا است.شیوع بالای این انگل در احشام ، فاسیولیازیس را به موضوع مناسبی برای تحقیقات بدل کرده است از سوئی قابلیت عجیب انگل در انطباق با شرایط جدید حیرت بر انگیز است [17].آلودگی انسان وحیوانات با بلع متاسرکر بر روی سبزیجات آلوده ازقبیل شاهی آبی و آب آلوده صورت می گیرد [1]. این انگل سالانه سبب خسارت 3 میلیارد دلاری در اثر تلف شدن حیوانات آلوده مخصوصا" گوسفندان وکاهش تولیدات دامی از قبیل گوشت وشیر در گاو می شود[6]. خسارت ناشی از دور ریزش کبدهای آلوده دراثر فاسیولیازیس در کشور ما سالیانه میلیونهاریال می باشد .تا سال 1987 موارد فاسیولیازیس بصورت اسپورادیک بودتا اینکه یک شیوع در گیلان اتفاق افتاد وحدود 10000 نفررا آلوده کرد [3،4]، شیوع بعدی حدود 10 سال بعد اتفاق افتاد وچند هزار نفر درگیر شدند[5] تخمین زده می شود حدود 4/2 میلیون نفر در دنیا به فاسیولا آلوده هستند وبیش از 180 میلیون در معرض خطر ابتلا هستند[17] .
بطور کلی موجودات زنده مواد زائد داخلی وخارجی را در سه فاز مشخص متابولیزه وسم زدایی می کنند : فازΙ عمدتا" بوسیله سیتوکروم P450 کاتالیز می شود.در فازΙΙ مولکول با یک ترکیب با وزن مولکولی کم مانند گلوتاتیون کونژوگه می شود ،وکونژوگاسیون معمولا حلالیت مولکول در آب را آفزایش داده وخاصیت سمی وفعالیت شیمیایی آن را کاهش می دهد .و در فازΙΙΙ کونژوگه های تشکیل شده ممکن است قبل از دفع یا تجزیه بیشتر متابولیزه شوند[7-8-9] از لحاظ کمی کونژوگاسیون گلوتاتیون احیا به وسیله گلوتاتیون –S- ترانسفراز((GST عمده واکنش فازΙΙ در کرمهای بالغ است[9] در این کرمها سیتوکروم P450 از اهمیت کمتری برخوردار است و آنزیم گلوتاتیون –S- ترانسفراز((GST از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است [10].
در انگل فاسیولا آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز (GST) حدود 4% کل پروتئینهای محلول را تشکیل می دهد [11,12] GSTها یک خانواده چند ژنی هستندکه در شش کلاس طبقه بندی می شوند: alpha ,mu ,pi ,theta ,sigma ,kappa ,zeta ,omega [13,14,15]
آنزیمGST در فاز ΙΙ سم زدایی با کاتالیز کردن کونژوگاسیون مواد خارجی (گزنوبیوتیکهای ) فعال شده با یک سوبسترای اندوژن محلول در آب مانند گلوتاتیون احیاء (GSH) حلالیت مواد خارجی را افزایش داده وخاصیت سمی و فعالیت شیمیایی آن را کاهش می دهد.
علاوه بر این نشان داده شده است که GST موجود درمواد دفعی-ترشحی (excretory-secretory) فاسیولا هپاتیکا از تکثیر سلولهای مونونوکلئر در طحال واز تولید نیترو اکسید(NO)توسط سلولهای پریتوئن جلوگیری می کند . [16].
با توجه به غلظت بالای آنزیم GST در فاسیولا ونقش فیزیولوژیکی مهمی که برای آن قائل هستند هدف ما از این مطالعه اندازه گیری سطح فعالیت این آنزیم و میزان پروتئین در مواد دفعی ترشحی (Excretory-secretory) انگل فاسیولا بوده است
روش کار:
تهیه نمونه و جداسازی انگل:
کبد آلوده به فاسیولا از کشتارگاه دام استان ایلام تهیه گردید وانگلهای آن بدقت جداسازی شد وچندین بار در بافرPBS (Nacl,NaH2PO4,Na2HPO4وPH=7/4) شستشو صورت گرفت.
تهیه مواد دفعی ترشحی (Excretory-secretory)از انگل:
تعداد 13 عدد انگل زنده فاسیولا درml 13 بافر وبه مدت 4 ساعت در انکوباتور37 درجه قرار گرفت،سپس انگلها از بافر جدا شده وبافر بدست آمده به مدت 30 دقیقه در دور g2000 ودر دمای 4 درجه سانتریفوژ شد وسپس قسمت روئی آن در دمای 80- درجه نگهداری شد وجهت اندازه گیری فعالیت آنزیم از آن استفاده شد.
اندازه گیری مقدار پروتئین نمونه:
برای اندازه گیری مقدار پروتئین از روش استاندارد برادفورد استفاده شد.
اندازه گیری فعالیت آنزیمGST در مواد دفعی ترشحی:
جهت بررسی فعالیت آنزیم از سوبسترای بین المللی آن یعنی 1 کلرو2و4 دینیتروبنزن ( (CDNB1-chloro-2,4-dinitrobenzeneاستفاده شد.جهت انجام آزمایش محلولهایGSHmM100و100mM CDNB وبافرPB 1/0مولار (K2HPO4,KH2HPO4) تهیه گردید. که واکنش با مشاهده افزایش جذب نوری درطول موج 340 نانومتر در اثر کونژوگاسیون GSH با CDNBو در حضور شاهد وتحت تاثیر GST موجود در نمونه با دستگاه اسپکتوفتومر بررسی شد.
با قرار دادن مقادیر بدست آمده در فرمولهای زیر میزان فعالیت انزیم (GST activity )GST بر حسب u/ml و فعالیت مخصوص آنزیم
(Specific enzyme activity ) بر حسب umol/min/mg proteinمحاسبه می شود
GST activity= Adjusted ∆340/min ∕ 0.0096 × 1.0 ml ∕0.1 ml ×any sample dilution
Specific enzyme activity = enzyme activity × 1 ∕ mg of protein
Total GST activity 3.177
GST specific activity 33.7
میزان فعالیت آنزیم GST( گلوتاتیونSترانسفراز)درES(Excretory-secretory) انگل فاسیولا 177/3 واحد در ml بود) یک واحد آنزیم مقداری از آنزیم است که باعث کونژوگاسیون يک ميکرو مول از CDNB با GSHدر یک دقیقه ودر دمای 25 درجه می شود)وبا توجه به میزان پروتئین در نمونه فعالیت ویژه آنزیم ) 33.7µmol/mg /min (Specific activity بدست آمد .
نتیحه گیری نهایی:
با توجه به نقش مهم آنزیم GST ( گلوتاتیون- S- ترانسفراز) در خنثی سازی مواد سمی داخلی و خارجی نتیجه می گیریم که انگل فاسیولا برای مقابله با مواد توکسیک داخلی وخارجی علاوه بر مکانیسمهایی که در خود انگل وجود دارد احتمالا" با ترشح آنزیم GST در مواد دفعی ترشحی ، مواد سمی را در دیگر قسمتهای بدن میزبان نیز خنثی می کند. و همچنین این احتمال وجود دارد که مقاومت انگل فاسیولا به داروی پرازیکوانتل در انسان به علت غلظت بالای این آنزیم در انگل باشد، لذا مطالعه بعدی ما در خصوص بررسی اثر بازدارندگی آنزیم GST بر داروی پرازیکوانتل می باشد.
تقدير و تشکر:
از آقایان مهندس شاهین و سلیمانی بخاطر همکاری در تهیه نمونه از کشتارگاه دام ایلام وپرسنل آزمایشگاه مرکزی بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران بویژه آقای محمد حسن فلکی مقدم بخاطر کمکهای آزمایشگاهی تقدیر وتشکر می نماید.
منابع:
1 .Dalton jp،editor.fasiolosis. oxford : CABI Poblishing :1999
2. Mas-Coma S, Bargues MD (1997). Human liver flukes: A review. Research and Reviews in Parasitology, 57: 144-225.
3. Massoud J (1990). Fascioliasis outbreak of man and drug test (Triclabendazole) in Caspian Sea Littoral, northern part of Iran. Bulletin de la Societe Française de Parasitologie, 8: 438.
4. World Health Organization (1995). Control of foodborn trematode infections. WHO Technical Report Series. World Health Organization, Geneva. No. 849: 1-157.
5. Forghan-Parast K, Ashrafi K (2001). [Comparision of the formalin-ether and Kato- Katz in the parasitological diagnosis of human fascioliasis]. Medical Faculty Journal of Gilan University of Medical
Sciences, 9 (35 36): 1-6.
6. Evidence Suggesting that Fasciola gigantica Might be the Most Prevalent Causal Agent of Fascioliasis in Northern Iran
K Ashrafi1, J Massoud 1, K Holakouei 2, M Mahmoodi 2 , MA Joafshani 3, MA Valero 4, MV Fuentes 4, M Khoubbane 4, P Artigas 4 , MD Bargues 4, S Mas-Coma 4
7. Francesco M.veronese and Paolo. Drug Delivery system. ealicoty/plenum publisher NEWYORK 2002
8. Barret J (1997): Helmint detoxification mechanisms. Jornal of Helmenthology, 71:85-89
9. Sheehan D, Meade G, Foley VM, DOWDCA (2001):structure, function and evolution of glutation transfrses : implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily. Biochem J,360: 1-16
10. Chemale G, Morphew R, Moxon JV, Morassuti AL, Lacourse EJ, Barrett J, Johnston DA, Brophy PM. Proteomic analysis of glutathione transferases from the liver fluke parasite, Fasciola hepatica
12. Wijffels,G.L.,Salvatore,L.,Pittitt,G.M.et al EXP. Parasitol.1992,74.87-99
13. Mannervick,B.(1985)Theisozymoftheglutathione-S-transfrese.Adv.Enzimol .Relat Areas Mol Biol.57.,357-413
14. Board,P.G,. Baker,R.T.,Chelvanyagam,G.& Jermin,L.S. (1977) Zeta a novel class of glutathione transfrases in a rang of species from plant to human. Biochem.J.328,928-935
15. Edwards, R., Dixon, D.P& Walbot, V.(2000)plant glutathion S-transferases enzymes with multiple function in sickness and in health . Trends. Plant.Sci.5,193-198
16- L. CERVI a1, G. ROSSI a1 and D. T. MASIH Potential role for excretory–secretory forms of glutathione-S-transferase (GST) in Fasciola hepatica
17-stites.D.P,Terr.A.I, Parslow.T.G: Basic clinical Immonology 1994 Apelton&Long 0891-2076
13:34 - يکشنبه 8 شهريور 1388 / شماره : 284 / تعداد نمایش : 374
چاپ 
ارسال به دوست
